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免疫法快速检测食品中黄曲霉毒素的研究进展

文档作者：毕水莲黄思敏文档来源：广东药学院食品科学学院		点击数：	更新时间： 2025年07月02日
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上一篇：免疫检测技术在食品检验中的应用

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第6 卷 第9 期 食品安全质量检测学报 Vol. 6 No. 9
2015 年9 月 Journal of Food Safety and Quality Sep. , 2015
基金项目: 国家自然科学基金项目(31401596)、广东省自然科学基金资助项目(S2013040013491)、广东省科技计划项目(2014A040401087)、
广东省医学科研基金项目(B2014205)和广东省大学生创新创业训练计划项目(201410573030)
Fund: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31401596), the Natural Science Foundation of Guangdong Province
(S2013040013491), Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (2014A040401087), Medical Scientific Research
Foundation of Guangdong Province (B2014205) and Undergraduate Training Programs for Innovation and Entrepreneurship of Guangdong
Province (201410573030)
*通讯作者: 毕水莲, 副教授, 主要研究方向为食品质量安全及检测技术研究。E-mail: bishuilian@163.com
*Corresponding author: BI Shui-Lian, Associate Professor, School of Food Science, Guangdong Pharmaceutical University, Zhongshan 528458,
China. E-mail: bishuilian@163.com
免疫法快速检测食品中黄曲霉毒素的研究进展
毕水莲*, 黄思敏
(广东药学院食品科学学院, 中山 528458)
摘要: 黄曲霉毒素(aflatoxin)是由霉菌黄曲霉和寄生曲霉感染后产生的次生代谢产物, 是自然界中毒性最强
的化合物之一, 被世界卫生组织的癌症研究机构(IARC)划定为I 类致癌物质, 与肝癌的发生密切相关。黄曲霉
毒素很容易污染谷物、坚果、香料、植物油脂、乳类及其制品等多种食品。因此, 研究出快速、准确、高效的
食品中黄曲霉毒素的检测方法是政府、企业和研究者们一直以来的共同目标。本文综述了近年来基于免疫技
术发展的各种快速检测黄曲霉毒素方法, 主要包括酶联免疫吸附测定法、胶体金免疫层析法、免疫传感器、免
疫亲和柱-高效液相色谱法、免疫荧光法、放射免疫法、时间分辨荧光免疫分析法和量子点探针法的基本原理、
适用范围、检测效果、优缺点及国内外应用等方面进展, 为今后研发更优的检测黄曲霉素新方法提供借鉴。
关键词: 黄曲霉毒素; 免疫法; 快速检测
Advances in the rapid detection of aflatoxin in foodstuffs by immunising
method
BI Shui-Lian*, HUANG Si-Min
(School of Food Science, Guangdong Pharmaceutical University, Zhongshan 528458, China)
ABSTRACT: Aflatoxin is secondary metabolites produced by Aspergillus species of fungi. As one of the most
toxic compounds in nature, aflatoxin has been classified by the International Agency for Research on Cancer
(IARC) as group I carcinogen and is closely related to the development of liver cancer. Cereals, nuts, spices,
vegetable oil, milk and their products are the most susceptible commodities to aflatoxin. Therefore, it is a
common goal for the government, enterprises and researchers to detect aflatoxin in foodstuffs rapidly,
accurately and efficiently. In this paper, the principle, effect, characteristics and application of the methods,
including enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), colloidal gold immunoassay, immunosensor assay,
immunoaffinity column clean-up and high performance liquid chromatography (HPLC), immunofluorescencebased
measurement, radio immunoassay, time resolved fluoroimmunoassay and quantum dots as fluorescent
probes assay based on immune technology, were reviewed, so as to provide important references for the
development of new superior detection methods of aflatoxin.
KEY WORDS: aflatoxin; immunising method; rapid detection
第9 期 毕水莲, 等: 免疫法快速检测食品中黄曲霉毒素的研究进展 3531
1 引 言
黄曲霉毒素(aflatoxin, AF)是由霉菌黄曲霉和寄生曲
霉感染后产生的次生代谢产物[1], 目前已发现的黄曲霉毒
素有20 多种[2], 主要为B1、B2、G1、G2、M1 和M2。从化
学结构上看, 各种黄曲霉毒素的结构非常相似, 均含有二
呋喃环和氧杂萘邻酮(香豆素)。黄曲霉毒素的理化性质比
较稳定, 难溶于水、己烷、乙醚和石油醚, 易溶于甲醇、乙
醇、氯仿、乙腈和二甲基甲酰胺等有机溶剂, 对光、热和
酸稳定, 遇碱后能迅速分解。黄曲霉毒素的毒性极强, 且具
有明显的致癌能力。其中AFB1 毒性最大, 致癌能力最强,
G1、M1 其次, B2、G2 和M2 相对较弱。AFB1 的LD50 为0.249
mg/kg, 属于特剧毒物质, 其毒性为氰化钾的10 倍、砒霜
的68 倍、三聚氰胺的416 倍。其致癌力为已知致癌物二甲
基亚硝胺的70 倍、奶油黄(甲基偶氮苯)的900 倍、六六六
的10000 倍, 1993 年被世界卫生组织癌症研究机构
(International Agency for Research on Cancer, IARC)划定为
I 类致癌物质[3]。
黄曲霉毒素广泛存在于谷物农产品和食品中, 因其
危害巨大, 世界各国普遍制定了黄曲霉毒素的最大限量标
准。我国卫生部规定玉米、花生仁、花生油中AFB1 的含
量不能超过20 μg/kg, 大米、其他食用油中AFB1 的含量不
能超过10 μg/kg, 豆类、发酵食品中AFB1 的含量不能超过
5 μg/kg, 鲜乳中AFM1 含量不能超过0.5 μg/kg, 婴幼儿食
品及乳粉中的黄曲霉毒素不得检出。美国联邦政府有关法
律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒素含量(指
B1+B2+G1+G2 的总量)不能超过 20 μg/kg, 牛奶中的含量不
能超过0.5 μg/kg。而欧盟规定比较严格, 要求人类生活消
费品谷物中的黄曲霉毒素B1 的含量不能超过2 μg/kg, 总
量不能超过4 μg/kg, 牛奶及奶制品中的AFM1 含量不能超
过0.05 μg/kg, 花生及其他直接供人类食用的坚果中黄曲
霉毒素含量(指B1+B2+G1+G2 的总量)不能超过5 μg/kg。这
些严格的黄曲霉毒素限量要求, 使得黄曲霉毒素的检测受
到了广泛关注。
免疫学方法具有特异性强、灵敏度高、快速简便等特
点, 近年来国内外学者不断将免疫学方法引入黄曲霉毒素
的测定中, 本文就近年来国内外广泛采用的食品中黄曲霉
毒素免疫检测法的研究进展进行综述。
2 黄曲霉毒素免疫检测方法研究现状
近年来, 国内外广泛采用的检测黄曲霉毒素的免疫
学方法主要有酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked
immunosorbent assay, ELISA)、胶体金免疫层析法、免疫传
感器、免疫亲和柱-高效液相色谱法、免疫荧光法和放射免
疫法(radio immunoassay, RIA)。其中ELISA 是最经典、最
常见的免疫学检测方法, 免疫亲和柱-高效液相色谱法是
现行的饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 测定的国标方法。
随着免疫学检测方法研究的深入进行, 一些新方法应运而
生, 如时间分辨荧光免疫分析法(time resolved
fluoroimmunoassay, TRFIA)、量子点标记荧光免疫法等, 检
测性能大大提高。
2.1 常规的黄曲霉毒素检测方法
2.1.1 酶联免疫吸附测定法(ELISA)
ELISA 的基本原理是将已知的抗原或抗体固定在固
相载体上, 再用标记的酶与底物反应而显色, 以此来判断
是否有相应的免疫反应[4]。该法的优点是反应特异性强、
灵敏度高、干扰小、样品预处理简便、检测结果准确且稳
定、成本低, 现已成为最常见的快速检测食品中霉菌毒素
的方法[5]。
Zhang 等[6]采用改良的两步筛选法筛选出与AFB1、
AFB2、AFGl 和AFG2 具有广泛交叉反应的单克隆抗体, 这
些抗体可用于同时分析样品中总黄曲霉毒素。Guan 等[7]
采用半固体筛选法筛选出了抗AFM1 的细胞株, 该细胞株
亲和力高, 且均不与AFB1、AFB2、AFGl 和AFG2 发生交
叉反应。利用此抗体建立的超灵敏间接竞争ELISA 方法,
可用于检测牛奶和乳制品, 检测限分别为3 ng/L 和6 ng/L,
样品检测时, 回收率为91%~110%, 变异系数小于10%, 与
高效液相色谱法(HPLC)检测法的相关性很好。Jiang 等[8]
研发出一种快速、简便、可靠的同时筛查不同食品基质中
AFB1 和AFM1 的间接ELISA 方法, 该法的平均回收率为
73%～121%, 相对标准偏差小于15%, 灵敏度与液相色谱
串联质谱联用法(LC-MS/MS)相近。所检测的8 个农产品中
AFB1 的检测限为(0.52+0.36) μg/kg(平均值+3SD), 4 种乳制
品中AFM1 的检测限为(0.031+0.015) μg/kg (平均值+3SD)。
Tsakiris 等[9]调查了希腊市场上婴幼儿奶粉中AFM1 的污染
情况, 采用ELISA 法检测了196 份奶粉样品, 结果阳性检
出率为46.5%, 其中2 份样品超过了欧盟要求的最大限量。
Yu 等[10]建立了一种高灵敏度的ELISA 方法。通过改变包
被抗体的浓度来改变抗体的活性, 使之达到最佳状态。改
进后的ELISA 法, 其灵敏度可达0.0015 ng/mL。Sun 等[5]
研究并评估了5 个用于检测AFB1 的商业ELISA 试剂盒的
质量, 结果表明, 5 个来自不同供应商生产的AFB1 试剂盒
的质量区别显著。
2.1.2 胶体金免疫层析法
胶体金免疫层析技术是于20 世纪80 年代在ELISA、
乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材
料技术的基础上发展起来的一种免疫分析方法, 它是以胶
体金为显色媒介, 利用免疫学中抗原与抗体能够特异性结
合原理, 在层析过程中完成反应, 从而进行检测。胶体金免
疫层析法在现场监控和大规模样品筛查时发挥了巨大作用,
已被广泛应用于生物学诊断检测, 在农产品质量安全检测
中也得到了应用[11-15]。
3532 食品安全质量检测学报 第6 卷
Wang 等[16]研制出一种用于检测乳及乳制品中的
AFM1 纳米金免疫层析试纸条。该试纸条检测AFM1 所需
时间为10 min, 检测限为0.028 ng/mL, 15 种受检乳及乳制
品中, 有6 种受到轻微的AFM1 污染, 所有样品中AFM1
含量均低于1 ng/mL。Song 等[17]研制出了针对黄曲霉毒素、
玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇3 类真菌毒素进行同
时定性、定量检测的免疫胶体金试纸条, 检测限分别为
0.05、1 和3 μg/kg, 回收率为80%~122%。Chen 等[18]建立
了基于胶体金抗体探针快速检测AFB1 的竞争免疫层析法,
该方法特异性强, 对其他常见的黄曲霉毒素(AFB2、AFM1、
AFG2、AFG1)基本无交叉反应。对AFB1 标准液和食品样
品的检测限分别为0.5 ng/mL、10 μg/kg。
2.1.3 免疫传感器
免疫传感器是将高灵敏的传感技术与特异性免疫反
应结合起来, 用于监测抗原抗体反应的传感器[19]。其基本
原理与传统的免疫检测方法一致, 也是将抗原或抗体固定
在载体上。特殊之处在于要运用传感器来测量电流、电位
等变化情况并以此达到检测的目的。因其具有快速、灵敏
和仪器设备简单等优点[20], 在用于黄曲霉毒素分析时受到
国内外研究者的广泛关注[21,22]。
Dinckaya 等[23]研制了一种新型免疫传感器用于快速
检测AFM1, 该传感器是以纳米金粒子为金电极, 搭配半
胱胺的单层膜, 外加探测器组成。其检测AFM1 的浓度范
围为1~14 ng/mL, 偏差为0.36 ng/mL。基于无标记的电化
学阻抗谱, Chen 等[24]研制了一种快速检测AFB1 的新型免
疫传感器。该传感器是由1,6-己二硫醇、胶体金、黄曲霉
毒素-牛血清白蛋白(AFB1-BSA)通过自组装技术的金电极
上逐步固定化而形成。在优化条件下, AFB1 检测浓度范围
为0.08~100 ng/mL, 阻抗增量呈线性关系, 相关系数为
0.9919, 检测限为0.05 ng/mL。冯甜等[25]采用循环伏安法对
使用AFB1 和羧基化单壁碳纳米管构建的双层免疫传感器进
行验证, 研究了抗体孵育时间和样品前处理方法对检测结
果的影响。结果显示AFB1 抗体和二抗的最佳孵育时间为90
min, 且不同的前处理方法对检测结果影响较大。此外, 粗提
溶液经过AFB1 亲和柱纯化、浓缩能够有效排除样品基质干
扰物对测定结果的影响, 并得出了电化学免疫传感器稳定
性受到抗体孵育时间以及样品前处理等因素影响的结论。
Liu 等[26]研制了一种基于CdS-Fe3O4 纳米复合材料检测花生
中AFB1 的光电管传感器。在最佳条件下, 该传感器的检测
限为5.0×10-3 ng/mL, 线性范围为0.1~80 ng/mL。
2.1.4 免疫亲和柱-高效液相色谱法
免疫亲和柱-高效液相色谱法是将样品中的黄曲霉毒
素用适当比例的甲醇-水的提取液进行过滤、稀释后, 用免
疫亲和柱净化, 甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来,
在淋洗液中加入溴溶液衍生, 以提高检测的灵敏度, 然后
用荧光分光光度计定量。也可以将甲醇-黄曲霉毒素淋洗液
的一部分注入HPLC 中, 对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2
分别进行定量分析[27]。
陈冬东等[28]将试样进行离心处理、免疫亲和柱净化后,
再应用液相色谱-紫外法检测牛奶及奶粉中AFM1。结果表
明, 不同加标水平下牛奶和奶粉添加AFM1 回收率分别为
87.4%~108%、89.5%~103%, RSD 分别为2.61%~7.83%和
2.07%~4.15%, 检测牛奶、奶粉样品的灵敏度分别为0.1
ng/mL、2.0 ng/g。朱鹏飞等[29]采用免疫亲和层析柱净化、
柱前衍生、高效液相色谱荧光检测器测定的方法, 分析粮
谷类食物(包括花生酱、大米、玉米)中AFB1、AFB2、AFG1、
AFG2 的含量, 结果表明在0.15~50 ng/mL 时, 所得回归方
程的相关系数均大于0.99, AFB1、AFG1 的方法检测限为
0.10 ng/g, AFB2、AFG2 的方法检测限为0.03 ng/g。该方法
的精密度为0.13%~9.5%, 加标回收率为70%~106%。
2.1.5 免疫荧光法
免疫荧光技术是将己知的抗原或抗体标记上荧光素
或有荧光的物质, 制成荧光标记物, 再用这种荧光抗体(或
抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗
体)。然后用荧光显微镜进行观察, 从而确定抗原或抗体的
性质, 并对其进行定位及定量分析[30,31]。该方法通常与免
疫层析法配合使用。
Beloglazova 等[32]用荧光标记技术定量测定牛奶中
AFM1, 得到的最低检出限达0.014 μg/kg, 假阳性和假阴性
结果的比率分别为2.6%和3.3%, 均低于5%。李卫丽[33]以
60%甲醇提取样品中黄曲霉毒素, 经免疫亲和柱净化、洗
脱后, 用荧光光度计进行检测, 将该方法与免疫亲和柱-高
效液相色谱法检测结果进行对比, 结果表明, 2 种方法的精
密度回收率高, 检出限均能够满足欧盟针对花生中黄曲霉
毒素最新限量的要求。
2.1.6 放射免疫法(RIA)
RIA 与ELISA 方法的原理相似, 唯标记物不同,
ELISA 标记的主要是类似辣根过氧化物酶一类的物质, 而
RIA 使用的标记物则是一类具有放射性的元素[34,35]。闰磊
等[36]采用放射免疫分析方法检测牛奶样品中黄曲霉毒素,
检出限可达0.25 g/kg。
2.2 黄曲霉毒素检测的新技术
2.2.1 时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)
TRFIA 是使用三价稀土离子代替酶标物或其他荧光
物质, 用时间分辨荧光仪来测定样品中荧光强度, 从而进
行定量。TRFIA 利用稀土离子的荧光波长与激发波长之间
的巨大差异, 克服了普通分光光度法中杂色光的影响, 因
而灵敏度得以提高。一般荧光物质光谱的Stokes 位移非常
小, 只有几十纳米, 导致激发光谱和发射光谱通常会出现
叠加到一起的现象, 彼此产生较大的影响。所以TRFIA 方
法的优点就在于镧系离子在经过一定的螯合反应后,
第9 期 毕水莲, 等: 免疫法快速检测食品中黄曲霉毒素的研究进展 3533
Stokes 位移能够达到200 nm 以上, 很容易分辨激发光和发
射光, 从而可以排除激发光的干扰, 此外, 它合成的螯合
物荧光的衰变时间非常长, 为传统荧光的103~106 倍[37]。
Huang 等[38]建立了以Eu3+螯合物为标签用于检测黄
曲霉毒素的双标记TRFIA, 结果表明, 该方法检测AFB1
的灵敏度为0.02 μg/L, 测量范围为0.02~100 μg/L, 批内和
批间变异系数分别为3.2%和7.3%, 平均回收率为88.1%。
张兆威等[39]通过对铕标记TRFIA进行方法学考核, 测定花
生、稻米、植物油等样品中AFB1。得出该法检测花生样品
中AFB1 的检测限为0.3 μg/kg, 线性范围为0.8～25 μg/kg。
批内添加回收率在81.0%～113.0%之间, 变异系数范围是
7.2%～14.2%; 批间添加回收率在75.8%~114.9%之间, 变
异系数范围是7.7%～15.3%, 批间和批内都具有良好的准
确度和精密度。
2.2.2 量子点标记荧光免疫法
量子点(quantum dots, QDs)又称半导体纳米晶体, 具
有良好的化学惰性、优良的荧光性能和良好的生物相容性,
且毒性低、易于合成[40]。与传统有机染料相比, 量子点具
有发射光谱窄、激发光谱宽、荧光可通过控制粒径进行调
节等光学特性[41], 被广泛应用于重金属检测、生物成像等
领域[42-47]。近年来, 将量子点作为一种新型荧光标记物的
免疫法开始逐步应用于黄曲霉毒素的检测[48]。
Zhang 等[49]提出了一种对AFB1 使用量子点作为荧光
标记的荧光免疫分析法。将T 碲化镉量子点成功连接到
AFB1 单克隆抗体上, 基于共轭配合物, 进行直接竞争链接
荧光酶联免疫吸附试验。在AFB1 空白花生示例设置的3
个级别(0.075、0.3 和0.15 ng/g)下, 得到的检测限为0.016
ng/mL, 回收率为85%~117%, 变异系数也小于10%。
3 各种免疫检测方法的比较
各种黄曲霉毒素免疫检测方法均有其各自的优缺点
及适用范围, 见表1。
表1 各种黄曲霉毒素免疫检测方法的对比
Table 1 Comparison of different detection methods of aflatoxin by immunising technology
检测方法 优点 缺点
ELISA
反应快速、灵敏度高、干扰小、对样品纯度要求不高、样
品预处理简便、检测结果稳定且准确, 适合大批量样品的
检测
对检测人员和酶标仪器的要求均较高, 检测时间
较长, 不适合现场快速检测
胶体金免疫层析法
操作过程简单, 不需要任何仪器设备, 成本低, 检测快速,
结果判定简单直观, 既适用于大批量样品中黄曲霉毒素的
初筛, 也适合现场的快速检测
灵敏度低, 只能定性检测
免疫传感器
操作简便、灵敏度高、有机溶剂的用量少、耗时短, 适合
痕量黄曲霉毒素的检测
实验结果复杂、检测系统抗干扰能力较差, 难以实
现产业化, 不适合大批量样品的检测
免疫亲和柱-高效
液相色谱法
无需荧光检测器, 灵敏度高, 前处理简便, 实用性强 分析成本高, 液相色谱仪价格及日常维护费用昂贵
免疫荧光法 特异性高, 抗原制备较容易
较难达到分析自动化, 检测成本较高, 样品处理完
全依赖免疫亲和柱, 未经色谱柱分离的样品提取
液, 如果遇到复杂的基质样品或共存干扰物, 可能
会导致结果出现偏差
RIA
灵敏度高, 特异性强, 前处理简单, 测定周期短, 检测速
度快
检测成本较高, 检测品种少, 标记物稳定性较差,
对环境和人体的污染非常严重
TRFIA 灵敏度高、线性范围宽, 重复性和稳定性好, 应用前景广阔极易受到环境中稀土元素的污染
量子点标记荧光免
疫法
量子点荧光强度大、寿命长、稳定性好, 方法简单易行, 应
用范围广
需要专门的检测仪器, 可能存在非特异性结合的
量子点, 从而降低量子点检测的灵敏度
3534 食品安全质量检测学报 第6 卷
4 结论与展望
黄曲霉毒素毒性强, 且容易污染食品, 对身体健康造
成极大的威胁。2015 年4 月24 日, 新修订的史上最严《中
华人民共和国食品安全法》经十二届全国人大常委会第十
四次会议审议通过, 并将于2015 年10 月1 日起正式施行,
意味食品安全问题已经成为了政府今后整治的重点工作之
一。以最为经济快捷、高效的手段提高食品中黄曲霉毒素
的检测能力是政府和企业迫在眉睫的刚性需求, 也是国内
外专家关注的热点。为保障食用者的健康及出口贸易需要,
提高黄曲霉毒素的检测能力, 发展快速、简便、准确、灵
敏的检测技术已经成为黄曲霉毒素研究中亟需解决的任务
之一。而黄曲霉毒素化学检测方法通常存在测试成本高、
分析时间长、检测所需样品量大(通常>500 mL)及前处理步
骤繁琐等缺点, 未来将会涌现更多、更好的免疫检测新方
法和新技术来克服这些不足。
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(责任编辑: 李振飞)
作者简介
毕水莲, 副教授, 主要研究方向为食
品质量安全及检测技术研究。
E-mail: bishuilian@163.com

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