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AlphaLISA技术在食品安全检测中的研究进展

文档作者：洪小柳吕敬章张恒范放刘慧玲赵芳文档来源：深圳出入境检验检疫局,		点击数：	更新时间： 2025年06月08日
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上一篇： ATP生物发光法评价餐饮具的微生物污染研究

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第5 卷第 1 期食 品安全质量检测学报Vol. 5 No. 1
2014 年1 月Journal of Food Safety and Quality Jan. , 2014
基金项目: 深圳出入境检验检疫局科技项目(SZ2011001); 国家科技支撑计划子课题(2012BA08B01-5)
Fund: Supported by Shenzhen CIQ Science &amp;amp; Technology Program (SZ2011001) and The national science and Technology Support Program
(2012BA08B01-5)
*通讯作者: 赵芳, 硕士, 工程师, 主要研究方向为食品微生物及兽药残留检测。E-mail: zf.ff@163.com
*Corresponding author: ZHAO Fang, Engineer, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, No.1011, Fuqiang Road, Futian District,
Shenzhen 518045, China. E-mail: zf.f @163.com
AlphaLISA 技术在食品安全检测中的研究进展
洪小柳, 吕敬章, 张恒, 范放, 刘慧玲, 赵芳*
(深圳出入境检验检疫局, 深圳 518045)
摘要: 纳米均相时间分辨荧光免疫法(AlphaLISA)是一种基于纳米微珠的光激化学发光的新型均相检测技术,
较传统的酶联免疫吸附测定(ELISA)具有均相、免清洗、敏感度高、特异性强等特点。本文介绍了AlphaLISA 的
原理和特点, 简要总结了近年来国内外AlphaLISA 技术的应用研究, 重点综述了食品安全领域(包括生物毒素和
药物残留)的研究进展, 并对此技术的发展前景进行了展望。
关键词: 纳米均相时间分辨荧光免疫法; 检测; 食品安全
Research progress of AlphaLISA technology in food safety detection
HONG Xiao-Liu, LV Jing-Zhang, ZHANG Heng, FAN Fang, LIU Hui-Ling, ZHAO Fang*
(Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045, China)
ABSTRACT: Homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay (AlphaLISA) is a new homogeneous detection
technology based on light stimulating of the chemiluminescence of nano micro-bead. Compared with the traditional
ELISA, the AlphaLISA has characteristics of homogeneity, free of cleaning, high sensitivity and specificity.
This paper introduced the principles and characteristics of AlphaLISA, briefly summarized the application
research of AlphaLISA technology at home and abroad in recent years, reviewed the research progress of
food safety field (including biological toxins and drug residues), and the future development of this technology
was also prospected.
KEY WORDS: homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay; detection; food safety
近年来食品安全问题层出不穷, 食品安全的快
速检测方法研究越来越受到人们的关注, 传统的免
疫学检测方法被广泛应用于食品安全检测。光激化学
发光纳米均相时间分辨荧光免疫法(AlphaLISA)技术
在分子生物学和医学领域上得到广泛应用, 但在食
品安全检测领域才刚刚起步。本文就目前AlphaLISA
技术在国内外的研究应用进展作一综述, 并且着重
对食品安全检测应用领域作出分析和展望。
1 光激化学发光技术的概述
纳米均相荧光免疫 (luminescent oxygenchanneling
immunoassay, LOCI) 在1994 年最初由Ullman
等[1]报道, 以均相、一步、免清洗的操作优势, 以高
灵敏度、特异性强和高通量的技术特点, 成为近几年
免疫研究分析的热点。目前, 美国PerkinElmer 公司
已生产多种相关试剂(AlphaScreenTM)。AlphaLISA
第1 期洪小柳, 等: AlphaLISA 技术在食品安全检测中的研究进展 199
技术是由 AlphaScreen 发展而来的用于高通量筛选的
光激化学发光技术。
1.1 AlphaLISA 的原理
AlphaLISA 技术的核心原理是单体氧的产生和
传递(图1)。AlphaLISA 检测试剂盒中包含感光微粒
和发光微粒两种微粒, 这两种微粒直径约为188 nm。
在两种微粒表面覆盖有一层水凝胶, 微粒通过水凝
胶表面的功能团与生物分子相偶联。每个微粒表面可
以覆盖成百上千个生物分子, 可捕获待测分子。当两
种微粒受到680 nm 的激光照射后, 感光微粒表面的
光敏剂就会将周围环境中的氧气转化为单体氧。单体
氧的传播直径约为200 nm, 如果发光微粒与感光微
粒之间的距离小于200 nm, 单体氧就能扩散至发光
微粒, 产生高能级的发光。相反, 如果发光微粒和感
光微粒的距离大于200 nm, 单体氧无法扩散至发光
微粒, 就不会有光信号的产生。AlphaLISA 均相反应
就是基于以上原理, 如果包被在两种微粒表面的生
物分子存在相互作用时, 就拉近了两种微粒之间的
距离, 产生光信号。通过对光信号的强度检测, 来判
断实际检测样品中有无待测目标物。
1.2 AlphaLISA 技术的特点
AlphaLISA 技术与传统ELISA 相比, 具有以下
多种优势: ①灵敏度高。采用的是纳米级微粒, 供体
微珠含有高密度的光敏剂, 增加了反应表面积, 极大
地提高了检测灵敏度, 灵敏度由ELISA 的10-10
mol/L[2]数量级提高到10-17 mol/L; ②均相反应模式实
现了一步、免清洗检测、操作简便、易于自动化、2 h
内完成整个实验流程; ③稳定性好。AlphaLISA 长波
长激发, 短波长发射, 能完全避免反应体系中的自发
光, 具有较强的抗淬灭能力, 检测过程也不易受到样
本组织干扰和pH 值、离子强度及温度等因素干扰; ④
样本用量少(低至5 μL 或更少), 更易实现小型化、芯
片化和高通量检测[3]; ⑤用途广泛, 可进行多种形式
的实验,包括竞争性实验、结合实验、解聚实验、多
种生物性分子间的检测等[4], 可以使用直接检测的方
式, 也可以选择间接检测的方式。
2 国内外的研究现状和应用
基于 AlphaLISA 技术的原理, 单体氧分子在溶
液中可扩散200 nm, 供体微珠和受体微珠在小于200
nm 的范围内都可被检测到。而其他均相技术, 例如
时间分辨荧光(TR-FRET)、荧光偏振(FP), 供体和受
体之间的距离为10 nm, 仅限于小分子的检测。
AlphaLISA 不受分子大小的影响, 可以应用于酶活
性、受体配体反应、DNA、RNA、蛋白、多肽、碳
水化合物等检测[5-9]。近年来, AlphaLISA 技术广泛
应用于多种组织、细胞来源的生物分子检测、新药物
开发分析[10]和临床医学病原体检验等领域。
2.1 分子生物检测
Poulsen 等[4] 用AlphaLISA 和ELISA 两种方法分
别定量人体血浆中的胰岛素含量。结果显示, 使用相
同的抗体条件下, 两种方法的定量结果一致性非常
好。AlphaLISA 方法不受血红素等样品中其他成分干
扰, 比ELISA 具有更高的灵敏度和精确性,
图 1 AlphaLISA 的技术原理[2]
Fig. 1 Principle of AlphaLISA
200 食品安全质量检测学报第 5 卷
只需要 ELISA1/5 的样本量, 就能达到比ELISA 低15
倍的检出限, 同时操作简便, 更易实现自动化。王柯
等[12] 应用ELISA、TRFIA 以及AlphalISA 技术建立
了小鼠肿瘤坏死因子的检测方法, 从反应动力学、方
法学参数、相关性等方面比较这三种方法, 结果显示
三种方法的相关性非常好, 而AlphaLISA 技术由于
不需要洗板孵育的过程, 耗时短、灵敏度高, 最适合
痕量样品的检测。
2.2 新药物开发
在药物研发过程中, AlphaLISA 技术对样本的小
型化和高灵敏度特点, 可以减少筛选成本、提高产量,
尤其对数量少又珍贵的样本极其重要。
2012 年, Schneider 等[13]使用AlphaLISA 技术将
泛素化结合矩阵作为通用组件检测泛素化蛋白。泛素
—蛋白酶体通路(UPP)是蛋白质的选择性降解中一项
非常重要的机制, 特别是在这个通路的E3 连接酶的
失调与多种疾病发生机理有关, 如癌症、炎症和代谢
性疾病。E3 连接酶是一类重要的药物靶标, 传统的
筛选技术通量低, 并多采用免疫印迹技术。
AlphaLISA 法结合生化检测能识别出泛素化E3 连接
酶的抑制因子, 废除发病机制。该方法未来在泛素的
药物开发和诊断上将有广阔的应用前景。
Beaudet 等[10]将生物素化的针对磷酸化的靶物质
的抗体作为一抗, 二抗直接偶联于受体微珠, 来分别
检测未受刺激的细胞及用抗癌药物治疗的细胞内靶
物质的去磷酸化作用, 结果Z 值达到0.9。
2.3 病原体检测
AlphaLISA 技术近两年已在国内被广泛应用于
乙肝病毒抗原抗体检测和试剂盒研制。马强等[14]应
用AlphaLISA 法来定量出人血清乙型肝炎病毒e 抗
体(HBeAb)浓度, 检测结果显示自制试剂盒灵敏度为
0.003 NCU/mL, 可测范围为0.003~16 NCU/mL, 136
份临床血样试剂盒测定数值有显著相关性, R 值为
0.961。自制试剂盒的各项指标能够达到临床检测要
求, 可取代昂贵的进口试剂盒应用于临床检测和基
础医学研究。
陈桂兰等[15]比较了AlphaLISA 法与电化学发光
免疫分析法(ECLIA)、ELISA 及胶体金法测定低浓度
HBsAg, 并评价AlphaLISA 测定HBsAg 的临床效果。
结果表明, AlphaLISA 检测HBsAg 与ECLIA 有很高
的符合率, 在低浓度的HBsAg 检测中, 可最大程度
地减少假阴性结果, 大大优于其他方法。由于
AlphaLISA已经实现了仪器和试剂的国产化, 成本较
低, 可以有效降低医疗费用且该法可进行自动化定
量检测, 适于临床使用。
在大量的可溶性抗原细菌和病毒的检测基础上,
Mechaly 等[16]首次报道了颗粒性抗原的检测, 即炭疽
芽孢杆菌孢子和保护性抗原(PA)在复杂样品中的检
测。为了避免供体珠聚集在孢子的表面上, 供体与受
体浓度比例应该高于4:1。检测灵敏度为106 孢子
/mL。兔血清中PA 的检测范围在10~100 pg/mL, 整
个检测过程只需50 min。该研究为检测其他颗粒性抗
原如细菌或病毒奠定了基础。
3 AlphaLISA 技术在食品安全检测中的研
究应用
AlphaLISA 技术虽在国内外已得到迅速的发展,
尤其在医学领域已广泛应用, 但在食品安全领域的
方法学研究和试剂盒研制方面的报道较少, 仅在生
物毒素和兽药残留上有报道。
3.1 食品中的毒素检测
毒素可分为动物毒素、植物毒素和微生物毒素,
其中微生物毒素包括细菌毒素、真菌毒素和藻类毒素
等。毒素对食品生产各个环节的危害性很大, 极少量
即可引起人中毒, 因此加强对其检测至关重要。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON) 又
称呕吐毒素, 主要由禾谷镰刀菌产生, 被欧盟分类为
三级致癌物。Bin 等[17]在用AlphaLISA 技术检测谷
物及制品中的DON时, 通过DON－BSA包被发光微
粒和DON 竞争DON 抗体, 与生物素化羊抗兔IgG
以及包被有链霉亲和素的感光微粒形成复合体, 建
立间接竞争DON 定量检测方法, 结果显示其灵敏度
达到0.007 ng/mL, 检测范围为0.007～100 ng/mL,。
该方法是目前DON 检测中最灵敏的方法之一。
微囊藻毒素(microcystin)是一种从蓝藻水华中分
离出的多肽毒素, 微囊藻毒素-LR 是毒素最强的一
种。我国生活饮用水标准限制饮用水中该毒素含量为
1 μg/L。钮伟民等[18]建立了微囊藻毒素-LR(MC-LR)
的纳米均相时间分辨荧光免疫分析法, 将偶联的
MC-LR 的牛血清白蛋白(MC-LR-BSA)人工抗原连
接到发光微粒, 抗MC-LR 单克隆抗体和亲和素通过
生物素连接感光微粒, MC-LR 人工抗原特异性地与
第1 期洪小柳, 等: AlphaLISA 技术在食品安全检测中的研究进展 201
生物素抗 MC-LR 单克隆抗体结合, 形成一个免疫复
合物, 拉近感光微粒和发光微粒, 激发级联放大化学
反应以大幅增强信号。其检出限达0.02 ng/mL, 与
MC-LR 的其他免疫测定法相比, AlphaLISA 方法的
操作简便、耗时短、高灵敏度、稳定性好的特点, 尤
其适合于生活饮用水中微量MC-LR 的分析。
3.2 食品中兽药残留物的检测
动物源性食品中的兽药残留问题近年来日益受
到人们的关注, 是食品安全中最重要的问题之一。动
物性食品中最常见的兽药残留是抗生素的残留。
江南大学的赵莉莉[19]建立了恩诺沙星的两种免
疫检测方法, 包括时间分辨免疫(TRFIA)和均相荧光
免疫技术(LICLIA)。恩诺沙星是一类具有良好杀菌效
果的动物专用药。TRFIA 法主要是利用双功能螯合
剂标记稀土銪离子和抗体, 采用两步法间接竞争模
式, 该检测灵敏度为5 ng/L, 检测范围为0.01~100
μg/L。LICLIA 法中最重要的影响因素是选择合适的
稀释比例, 该实验中选择了Enrofloxacin-OVA-发光
珠 1: 500、抗恩诺沙星多克隆1: 2500、生物素化羊
抗兔抗体1: 200 的浓度稀释比例, 两步反应仅需要
30 min, 其方法灵敏度为2 ng/L, 检测范围为
0.007~100 μg/L, 将两种免疫检测方法和酶联免疫分
析法(ELISA)进行方法相关性的比较, 结果表明三种
方法的相关性很好, LICLIA 法的灵敏度最高, 可应
用于样品更复杂的检测目的。
氯霉素(Chloramphenicol)是一种广谱抗生素。由
于其具有效果好以及价格低廉等优点, 已被普遍应
用于各类家禽、家畜、水产品及蜂制品的各种传染性
疾病的治疗。Zhang 等[20]首次用AlphaLISA 法对牛
奶、蜂蜜和鸡蛋中的氯霉素(CAP)进行检测时, 因
CAP 作为小分子物质, 是半抗原没有免疫原性, 故
采用混合酸酐法活化, 再与大蛋白偶联, 形成
CAP-BSA 和CAP-OVA 结合物。该方法的灵敏度为
0.0086 ng/mL, 低于ELISA方法的灵敏度0.05 ng/mL,
检测范围为0.0096~20 ng/mL,可达3-5 个数量级, 整
个操作在30 min 内完成, 可以进行384、1536、3456
孔板的高通量检测。
4 展 望
近年来, 食品安全的重要性越来越凸显, 动物
源性食品在人们的日常生活中所占比重越来越大,
尽快建立食品中兽药和生物毒素等有害物质残留的
高灵敏快速筛选检测方法已成为当务之急。目前, 食
品中兽药和生物毒素有害物质残留的检测方法包括
气质联用法、液质联用法、放射受体法(Charm II)和
酶联免疫法(ELISA)[21]。气质联用法和液质联用法检
测灵敏度高、特异性强但普遍存在着仪器昂贵, 方法
复杂, 操作烦琐, 试剂消耗量大的局限性, 不适用快
速检测技术; 放射受体法(Charm II) 法可达到
μg/kg(ppb)级的检测灵敏度, 但由于检测的物质范围
有限, 而且检测成本居高不下, 其推广应用受到限制;
酶联免疫法(ELISA)由于操作简便、检测成本低和检
测通量高而被广泛应用, 是目前最为高效和普遍使
用的检测筛选技术, 但随着食品检测向着更加痕量
级发展, 传统ELISA 的灵敏度已不能满足快速检测
的要求。
AlphaLISA 技术是超微量检测领域中出现的新
兴检测技术, 被誉为免洗的ELISA, 具有快速、均相
(免洗)、高灵敏、量程宽和操作简便的特点[22,23], 非
常便于快速筛选和自动化。目前, 高通量的生物标志
物筛选分析对于自动化检测仪器平台的要求较迫切,
AlphaLISA 技术将是未来致病菌、生物毒素和抗生素
残留快速检测平台的发展方向。
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(责任编辑: 张宏梁)
作者简介
洪小柳, 本科，工程师，主要研究方
向为食品微生物及兽药残留检测。
E-mail: siluerhxl@163.com
赵芳, 硕士, 工程师, 主要研究方向
为食品微生物及兽药残留检测。
E-mail: zf.ff@163.com

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