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酶联免疫吸附技术在食品检测分析中的研究进展

文档作者：石超吕长鑫冯叙桥李萌萌刘苏苏文档来源：渤海大学化学化工与食品安全学院辽宁省食品安全重点实验室,		点击数：	更新时间： 2025年07月10日
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第5 卷 第10 期 食品安全质量检测学报 Vol. 5 No. 10
2014 年10 月 Journal of Food Safety and Quality Oct. , 2014
基金项目: 辽宁省科技厅农业攻关计划项目(2011205001)、渤海大学人才引进基金项目(BHU20120301)、“十二五”国家科技支撑计划项
目(2012BAD29B06)
Fund: Supported by Agriculture Brainstorm Project of Technology in Liaoning Province (2011205001), Talents Introduction Fund Project of
Bohai University (BHU20120301) and “the Twelfth Five” National Key Technology R &amp;amp; D Project (2012BAD29B06)
*通讯作者: 吕长鑫, 教授, 主要研究方向为农产品贮藏加工与食品资源开发。E-mail: lvchangxin6666@163.com
冯叙桥, 教授, 主要研究方向为果蔬质量与安全控制。E-mail: feng_xq@hotmail.com
*Corresponding author: LV Chang-Xin, Professor, Food Science Research Institute of Bohai University, No.19, Science and Technology Road,
Mstsuyama District, Jinzhou 121013, China. E-mail: lvchangxin6666@163.com
FENG Xu-Qiao, Professor, Food Science Research Institute of Bohai University, No.19, Technology Road, Songshan District, Jinzhou 121013,
China. E-mail: feng_xq@hotmail.com
酶联免疫吸附技术在食品检测分析中的研究进展
石 超, 吕长鑫*, 冯叙桥*, 李萌萌, 刘苏苏
(渤海大学化学化工与食品安全学院, 辽宁省食品安全重点实验室, 锦州 121013)
摘要: 酶联免疫吸附技术(ELISA)是酶免疫测定技术中应用最广泛的技术, 是将已知的抗原或抗体吸附在固
相载体表面, 使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行, 通过酶与底物产生颜色反应, 用洗涤法将液相中的游
离成分除去后再进行定量测定。主要分为夹心法、间接法和竞争法。本文简要介绍了几种常用方法及其基本
作用机制, 详述了ELISA 检测技术在食品检测中具体应用及发展历史与现状, 对其在食品中农药残留、病原微
生物、生物毒素、转基因食品、重金属残留、过敏性残留物及违规添加成分检测等方面的应用情况进行系统
总结, 并对其发展前景进行了分析。
关键词: 酶联免疫吸附; 食品检测; 研究进展
Advances in food determination and analysis of enzyme-linked
immunosorbent assay
SHI Chao, LV Chang-Xin*, FENG Xu-Qiao*, LI Meng-Meng, LIU Su-Su
(College of Chemistry, Chemical Engineering and Food Safety, Bohai University, Food Safety Key Lab of Liaoning
Province, Jinzhou 121013, China)
ABSTRACT: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is the most widely used technique in the enzyme
immunoassay techniques. The antigen or antibody is adsorbed on the surface of the solid phase carrier, antigen-
antibody reaction on the surface of the carrier, produce a color reaction by the enzyme and substrate, then
quantitative determination after washed the free ingredients of the liquid phase. The ELISA technique is mainly
divided into sandwich method, the indirect method and competition law. This paper describes the common method
and basic mechanism of action of the enzyme-linked immunosorbent assay, and details their specific application
and development in detection of pesticide residues, pathogenic microorganisms, biotoxins, genetically
modified food, heavy metal residues, allergic residues and illegal additives, and finally summarizes and analyzes
its prospects.
KEY WORDS: enzyme-linked immunosorbent assay; food detection; research progress
3270 食品安全质量检测学报 第5 卷
1 引 言
酶是一种有催化作用的蛋白质, 具有高效和专一等
特点。目前, 国际生物化学联合会把酶分成氧化还原酶类、
转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和合成酶类六
大类[1]。自1894 年日本学者高峰让吉首次应用酶制剂, 到
20 世纪前半叶西方国家把木瓜酶、胰酶、细菌淀粉酶分别
用于啤酒、制革和纺织行业中, 至今, 酶制剂已广泛应用于
食品、印刷、医药、石油化工等各大领域[2]。
近年来, 国内外将酶制剂应用于食品的分析检测中,
有效地提升了食品检测的速度和准确性, 在特异性和灵敏
性方面也明显优于其他检测方法, 显著提高了检测的效
率。酶联免疫吸附(ELISA)技术, 又称酶标法, 是一种在免
疫酶学基础上发展起来的新型免疫测定技术, 此法在食品
检测方面更表现出很大优势, 并在该领域迅速发展。本文
将对ELISA 在食品中检测应用及研究进展进行总结。
2 酶联免疫吸附(ELISA)技术
酶联免疫吸附技术起始于瑞典学者Engvall 和
Perlmann 在1971 年发表的《酶联免疫吸附试验用于IgG
定量测定》的文章中[3], 这项技术的产生, 使1966 年用于
抗原定位的酶标抗体技术发展成为可测定液体标本中微量
物质的一种新方法[4,5]。此项技术较之于传统的分析检测方
法, 具有实用性强、灵敏度高、选择性好、分析结果准确
等一系列优点, 故ELISA 已广泛应用于生物学、临床医学、
食品分析、分析化学等各大领域。
2.1 ELISA 基本原理及优点
酶联免疫吸附技术是将免疫活性未被破坏的抗原或
者抗体结合到特定固相载体的表面, 使其与某种酶结合成
酶标抗原或抗体, 此酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,
又保留了酶的活性。在测定时, 将含待检抗体或抗原的受
检标本和酶标抗原或抗体按照不同的程序步骤与固相载体
表面的抗原或抗体反应, 得到抗原或抗体的复合产物, 过
程见图1。接着, 通过洗涤方式使固相载体上抗原或抗体的
复合物与其他物质分离, 最后固相载体上的酶量与标本中
待检物质的量成一定比例。加入酶反应底物后, 底物经酶
催化形成有色产物, 此产物的量与标本中受检物质的量有
直接关系, 故可根据颜色反应对结果进行定性或定量分
析。由于酶催化频率极高, 因此反应效果可最大化显示, 可
使测定结果具有很高的敏感度, 使结果高度可信[6-9]。
2.2 ELISA 方法类型
ELISA的测定方法分类并无统一标准, 但可根据试剂
来源、标本性状及检测条件等方面将现有的检测技术分为
夹心法、间接法、竞争法和捕获法四种方法。每种ELISA
检测方法的特点和应用见表1。
除上述几种方法外还有ELISA 与其他方法或成分相
结合的检测方法, 如ABS (avidin biotin system)-ELISA 法、
PCR-ELISA 法、斑点免疫酶结合试验(DIA)等[12]。可根据
条件及要求自主设计适当的测定方法。使检测过程更简单
快捷, 结果更准确。
3 ELISA 在食品检测中的发展及应用
3.1 食品中农药残留的检测
农药残留是在农业生产中施用农药后, 一部分农药
直接或间接的残留于谷物、果蔬等食品中的一种现象。农
药残留目前已成为我国主要的食品安全问题之一, 直接影
响我国农副产品的质量[13]。
自1977 年, Ercegnvich 等[14]首次将免疫技术应用于对
硫磷的检测, 打破了传统的复杂且需要昂贵仪器的检测技
术, 使农药残留检测技术迈入了一个新的高度。1994 年
Ibrahim 等[15]采用杂交瘤技术制备对硫磷特异性单克隆抗
体, 并使用ELISA 技术检测其含量, 实现了将ELISA 应用
到有机磷农药的检测。2000 年, Katsoudas 等[16]建立了检测
新鲜食品中氨基甲酸酯类杀虫剂残留的ELISA 方法, 并在
樱桃、香蕉、桃子和西红柿等水果中应用ELISA 检测胺甲
萘及虫螨威两种杀虫剂。2003 年, Lee [17]等深入的研究了
乙酰甲胺磷的酶联免疫分析方法, 首先选择并合成了五种
半抗原, 通过免疫得到其抗体, 成功建立乙酰甲胺磷的
ELISA 检测方法, 在异源ELISA 检测体系中, 检测的IC50
为25 ng/mL, 最低检出限达到了2 ng/mL, 且此法的特异
图1 抗原或抗体复合物后显色反应
Fig. 1 Color reaction after the complex with the antigen or antibody
第10 期 石 超, 等: 酶联免疫吸附技术在食品检测分析中的研究进展 3271
表1 ELISA 检测方法及特点[10,11]
Table 1 The method and characteristics of ELISA[10,11]
方法 特点 应用
夹心法
分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认, 因此专一性相当高, 但此待测抗原必须是
多价抗原, 如此才可获得两种以上的专一性抗体, 以分别进行夹心
夹心法
通常用于检测抗原。
间接法
此法只需更换不同的固相抗原, 可用一种酶标抗体对各种相应的抗体进行检测检测, 故称为间
接法。
间接法
通常用于检测抗体。
竞争法
当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原, 或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上
时, 一般会考虑使用竞争法ELISA。
应用较少, 多数用于
检测小分子抗原
捕获法
血清中针对某些抗原的特异性IgM 常和特异性IgG 同时存在, 后者会干扰IgM 抗体的测定。先将
所有血清IgM(包括异性IgM 和非特异性IgM)固定在固相上, 在去除IgG 后再测定特异性IgM。
测定IgM 抗体
表2 主要农药残留的酶联免疫分析
Table 2 The main pesticide residue analysis by ELISA
农药类别 农药名称 测定方法 抗体类型 测定样本 检测限
杀虫剂
对硫磷 RIA ELISA 多抗、单抗 蔬菜、血浆 0.28~20 ng/mL
杀螟松 ELISA 多抗、单抗 谷物 80~100 μg/kg
甲胺磷 ELISA 多抗 蔬菜、谷物 0.032~500 ng/mL
西维因 ELISA 多抗 奶、蜂蜜、肉类、水 0.01~100 ng/mL
呋喃丹 ELISA 多抗 奶、肉类、血浆 0.01 mg/L
灭多威 ELISA 多抗 兔毛 0.9 ng/g
菊酯(总量) ELISA 多抗 肉类 50~500 μg/kg
氰戊菊酯 ELISA 多抗 水 0.1~4.8 μg/L
甲基嘧啶硫磷 ELISA 多抗 谷物 30 μg/kg
杀菌剂
多菌灵 ELISA 多抗 果汁、土壤、水 0.1~300 ng/mL
噻菌灵 ELISA 多抗、单抗 果汁、蔬菜、肉类 9~20 ng/g
克菌丹 ELISA 多抗 果汁 1 mg/mL
异菌脲 ELISA 多抗 啤酒、果汁 0.15~10 μg/kg
硝苯唑 ELISA 单抗 肝脏 20 μg/kg
福美双 ELISA 多抗 叶类蔬菜 5 ng/mL
除草剂
草甘膦 ELISA 多抗 水 0.076 mg/mL
百草枯 ELISA 多抗 奶制品、肉制品 2.5 ng/mL
2.4-D ELISA 多抗 奶制品、土壤、水 1~50 ng/mL
麦草畏 ELISA 多抗 水 0.23 mg/L
西玛津 ELISA 多抗 水、奶粉 1~10 ng/mL
莠去津 ELISA 多抗 土壤、水 0.01 ng/mL
吡草胺 ELISA 单抗 土壤、水 0.05~0.1 ng/mL
氯磺隆 ELISA 多抗 土壤 0.1 μg/mL
阿特拉律 ELISA 多抗 奶、果汁、玉米 0.5~2 μg/kg
3272 食品安全质量检测学报 第5 卷
性很好, 对结构相类似的甲胺磷农药几乎无交叉反应。同
年, 国内学者朱国念等[18]利用直接竟争ELISA 试剂盒来检
测克百威杀虫剂, 结果表明, 该试剂盒最低检测限为 0.01
mg/L, 样品的检测结果表明其批内、批间、整体变异系数
均小于8%, 回收率均达到90%以上, 符合农药残留的检测
分析要求。随着研究的深入, 越来越多的ELISA 检测方法
应用到了农药残留检测中, Kumar 等[19]、Yang 等[20]、Jee
等[21]分别利用不同的单克隆抗体或多克隆抗体, 建立了有
机磷农药残留的ELISA 检测方法, 且结果表明此类方法灵
敏度高、特异性好, 对其他有机磷农药几乎无交叉反应。
2008 年, 张骏等[22]研究了测定食品中硫丹残留ELISA 检
测方法, 得到结果的样品添加回收率为82.6%~112 %, 变
异系数为3.65%~16.97%, 通过与气象色谱法的分析结果
进行比对, 确定了ELISA 方法测定农药残留的可行性。文
孟棠等[23]在2014 年通过间苯氧基苯甲酸(PBA)为半抗原,
使用活性酯法、混合酸酐法和6-氨基己酸法偶联鸡卵清
蛋白(OVA)制备出三种抗原, 成功建立了大白菜中拟除虫
菊酯类农药残留的酶联免疫吸附检测试验。ELISA 至今
已成为众多权威机构检测分析农药残留的首选方法, 并
已建立几十种检测方法, 其中包括了几乎所有的杀虫剂、
杀菌剂、除草剂等农药的ELISA 检测方法。具体如表2
所示[24]。许多发达国家, 如英、美、德国等已开发出相应
的商品ELISA 检测试剂盒可用于直接检测果蔬等植物性
食品中的农药残留[25]。
3.2 食品中病原微生物的检测
当食品被病原微生物污染后, 被人体摄入体内会引
起人体病变、中毒甚至突变、致癌等危害, 所以病原微生
物的检测在食品检测中尤为重要[26]。
1986 年, Lin 等[27]采用ELISA 方法对番茄酱中的三种
霉菌进行检测, 结果表明该检测法灵敏度高于化学试剂检
测, 为病原微生物检测方式的创新提供了新的思路。随后,
文其乙等[28]1995 年从四株已获得的沙门氏菌属特异杂交
瘤单克隆抗体中, 筛选出CB8 和De7 两株合成的单克隆抗
体酶标检测试剂, 建立了一种直接ELISA 方法用以检测沙
门氏菌, 结果表明此法快速、高效、灵敏且结果准确。而
Yu 等[29]在2004 年间接法ELISA 测定VBNC 大肠杆菌
O157: H7 的实验也充分揭示了ELISA 在食品中病原微生
物的检测中的优势及前景。2012 年, 吴大成等[30]建立了双
抗夹心法ELISA 检测肠出血性大肠杆菌O157, 结果显示
此法只对O157 菌株有特异性反应, 与其他菌株无交叉反
应。并通过敏感性试验确定其在牛肉、猪肉和鸡肉中的检
出限为0.4~4 CFU/g。目前ELISA 法已可用于检测食品中
沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、军团菌、大肠杆菌等致病微
生物。传统的病原微生物检测方法检验周期长且精密度低,
甚至通过肉眼观察计数, 结果缺乏准确性。因此, 在一定程
度上使ELISA 在病原微生物检测方面有了很大的利用价
值和发展空间。
3.3 食品中生物毒素的检测
生物毒素为一大类生物活性物质的总称, 是各类生
物产生菌在适合产毒的条件下所产生的次生代谢产物。其
结构通常不会受到加热、烹调等热处理及一般的食品加工
处理方式的影响, 所以食品中生物毒素的检测在检验食品
安全性中十分重要[31]。
目前粮油类食品中污染最重、毒性最强的真菌毒素是
黄曲霉毒素。1977 年, LaWell 等[32]人首次应用ELISA 法
检测黄曲霉毒素, 利用小分子黄曲霉毒素B1结合蛋白质免
疫动物从而得到抗黄曲霉毒素B1 的免疫球蛋白, 合成了酶
标黄曲霉毒素B1 结合物, 并建立直接竞争ELISA 法以检
测黄曲霉毒素B1。随后, Chu and Morge 等[33]对此法进行改
进, 建立了间接竞争ELISA 法。我国也在1997 年出台了
《食品卫生理化检验方法》(GB/T50009.22-1996), 将两种
ELISA 检测方法列入国家标准。经过深入研究, 国内学者
刘冬儿[34]在2002 年使用ELISA 法测定了食品中黄曲霉毒
素B1, 线性范围为0.25~5.0 ng/mL, 检测灵敏度达到了
0.015 μg/kg, 是薄层色谱法的300~400 倍, 回收率高于
89.2%, 精密度在7.67%以上, 且整个测定过程仅为4 h,
极大缩减了检测周期。其结果充分表明ELISA 检测黄曲
霉毒素B1 高效、快捷且结果可信度高, 效果理想。2009
年, 董雪等[35]采用直接竞争ELISA 法检测河豚毒素。通
过过碘酸钠氧化法合成了酶标记抗原, 对合成的酶标记
抗原使用直接ELISA 法进行检测, 以表明其与抗河豚毒
素单克隆抗体之间存在特异性反应, 在此基础上建立了
直接竞争ELISA 法用以检测河豚毒素。结果表明ELISA
法检测河豚毒素具有高灵敏度、特异性好及高效率等优点,
可用于河豚毒素的定量检测, 并可进一步开发成为商品化
的ELISA 试剂盒。
3.4 转基因食品的检测
早在1983 年世界上首个转基因作物诞生至今, 转基
因技术发展迅速, 全世界已有50 多个国家开展转基因实验,
特别在农作物的基因改良方面更是突飞猛进[36]。
在1999 年, Rogan 等[37]首次使用ELISA 法检测出混
有2％Roundup Read 大豆的传统大豆制品中的CP4-EPSPS
蛋白质。并通过此法的高选择性和灵敏性, 证实了ELISA
检测方法在转基因食品的检测中具有可利用性。2001 年,
林良斌等[38]采用ELISA 方法检测到Bt1 杀虫蛋白基因在转
基因油菜中的表达。2002 年, 刘光明等[39]利用纯化的Btl
杀虫晶体蛋白作为免疫抗原, 通过抗体-抗原-酶标抗体反
应, 建立了ELISA 检测方法, 定量检测转基因玉米中的
Bt1 蛋白, 并用所建立的ELTSA 法分别对四种进口玉米产
品进行了检测, 结果与进口试剂盒方法的定量分析结果相
一致, 因而确定所建立的ETISA 简便快捷且结果准确, 证
第10 期 石 超, 等: 酶联免疫吸附技术在食品检测分析中的研究进展 3273
明了ELISA 检测技术在转基因食品检测中有很大发展前
景。2007 年, 顾炜炜等[40]在酶标抗原和多克隆抗体的基础
上, 研制出Btcry2Ab/2Ac 杀虫蛋白的直接竞争 ELISA
试剂盒, 可对其转基因蛋白进行快速、大批量的检测分析。
这一系列研究使ELISA 技术在转基因食品的蛋白水平检
测中迅速发展。美国率先研究出利用双夹心ELISA 法检测
食品中的转基因玉米成分, 并通过美国食品药品监督管理
局(FDA)认证, EnviroLogix ELISA 试剂盒可以测定玉米中
的Cry9C 蛋白。目前世界各国的专家学者正在研究更多用
于检测转基因食品的ELISA 试剂盒。
3.5 食品中其他成分的检测
3.5.1 食品中重金属残留的检测
金属硫蛋白是一种对重金属离子有很强亲和力的低
分子量蛋白质, 含丰富的半胱氨酸(约1/3), 不含芳香族氨
酸和组氨基酸。刘功良等[41]介绍了以金属硫蛋白制备金属
免疫原, 进而建立竞争性ELISA 检测方法对重金属离子浓
度进行检测[42]。
3.5.2 食品中过敏性残留物的检测
牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类(虾、蟹、龙虾)、花生、大
豆、核果类(杏、板栗、腰果等)及小麦八类食品中可能含
有过敏性成分, 其中多数为蛋白质, 会引起食用者的过敏
反应。目前已有建立夹心ELISA 法以检测鸡蛋过敏性蛋白
质、花生蛋白过敏物、β-球蛋白过敏物等的相关报道[43]。
3.5.3 食品中违规添加成分的检测
李霜等[44]通过对灵敏度、特异性、可重复性、检出限
等方面对市售的三聚氰胺ELISA 检测试剂盒进行评价研
究, 研究表明该试剂盒具有较好的准确性、特异性及重复
性, 批间变异与耐变性也在可接受范围内, 结果表明该法
可用于液态奶、乳粉中三聚氰胺残留的检测。
除上述几种食品中成分的检测外, ELISA 技术还可
应用于食品中其他成分的测定, 如功能性因子、毒品生物
碱、违禁添加剂、营养素、抗生素残留等。目前也有相关
研究报道, 但尚处于发展起步阶段且与其他检测方式相比
优势并不明显, 故不在此一一赘述。
4 结语与展望
目前ELISA 技术已被应用于诸多的食品检测领域,
与其他检测方式相比, 不需要昂贵的精密仪器, 降低了测
定成本, 同时也显示出其本身的方便、快捷、灵敏度高、
检测结果准确等众多优势。而对其研究却仍处于起步阶段,
尤其我国在这方面的研究较之国外存在一定的差距。
ELISA法检测食品同样存在一定弊端, 如难以同时分
析多种成分, 对某些结构类似物的分析检测仍会出现交叉
反应影响检测结果, 过度依赖试剂的选择等。这些问题导
致目前食品安全检测中ELISA 检测技术具有一定的局限
性, 这就需要更多学者对其进行深入研究。可通过研究开
发可催化不同底物反应生成不同颜色的酶制剂以达到同时
测定多种成分; 开发高度免疫性的重组抗原来代替无法分
离的原始抗原物质; 与其他检测方法如PCR、色谱技术等
相结合等一系列方式对ELISA 检测技术进行深层次研究,
扩大其优势、改善弊端。相信通过不断深入的研究, ELISA
技术在未来食品安全的快速检测技术中将占据越来越重要
的地位, 从而使食品安全检测技术愈加简单方便。
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(责任编辑: 白洪健)
作者简介
石 超, 硕士研究生, 主要研究方向
为农产品贮藏加工。
E-mail: shichao0147@163.com
吕长鑫, 教授, 主要研究方向为农产
品贮藏加工与食品资源开发。
E-mail: lvchangxin6666@163.com
冯叙桥, 教授, 主要研究方向为果蔬
质量与安全控制。

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