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上转换发光免疫层析技术及其在食品安全检测中的应用

文档作者：任舒悦1 姜会聪1一，彭媛1，白家磊1宁保安1，高志贤文档来源： 1．军事医学科学院卫生学环境医学研究所 2．郑州大学公共卫生学院		点击数：	更新时间： 2025年07月02日
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上一篇：石墨炉原子吸收光谱法测定奶粉中的铅和镉

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第7卷第5期
2016年5月
食品安全质量检测学报
Journal of Food Safety and Quality
Vbl．7 No．5
May，2016
上转换发光免疫层析技术及其在食品安全
检测中的应用
任舒悦1，姜会聪1一，彭媛1，白家磊1宁保安1，高志贤p
(1．军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室，天津300050；
2．郑州大学公共卫生学院，郑州450001)
摘要：食品安全是关系到亿万人民健康生活的头等大事，保障食品安全的快速检测技术在不断进步。传统的
理化检测方法存在样品前处理复杂、耗时费力、成本居高不下等问题，只能作为疑似样品的确证方法，不能满
足质量安全监督现场筛查的需求。上转换发光免疫层析技术是建立在功能化上转换发光纳米材料与抗原抗体
特异结合的层析技术基础上的一种新兴技术，具有灵敏度高、特异性强、使用便捷、检测速度快等特点，被广
泛应用于快速检测过程中。本文对上转换发光技术及免疫层析技术进行了简要介绍，主要对上转换免疫层析技
术以及其在食品安全检测领域的应用进展进行了综述。通过分析目前技术的优点与不足，根据目前的应用领域，
提出了发展方向，为该技术在食品安全领域的进一步应用提供了参考。
关键词：上转换发光；免疫层析；食品安全检测
Up--converting phosphor technology--based immunochromatographic assay
and its application in the field of food safety detection
REN Shu—Yuel，JIANG Hui．Con91，2，Peng Yuanl，BAI Jia-Leil，NING Bao—Anl，GAO Zhi．Xianl‘
(1．刀口形in Key Laboratory ofRisk Assessment and Control Technologyfor Environment and Food Safety，Institute of
Health and Environment Medicine，Military Medical Sciences，乃明，in 300050，China；
2．School ofPublic Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China)
ABSTRACT：Food safety is one of important things in the healthy lives of billions of people，and rapid detection
technology for food safety was constantly progressive．The traditional physical and chemical methods exist many
problems to be solved，such as complex sample preparation，time consumption and high cost，which can only be used
for confirming the suspected samples but not for the screening on the scene．However，up-converting phosphor(UCP)
technology—based immunochromatographic assay，a new technique，which is based on functional up-converting
phosphor and the special combination of antigen—antibody,has the characteristics of high sensitivity,high specificity,
ease to use，rapid detection and so on，being widely used in the process of rapid detection．In this paper,it took a brief
introduction to immunochromatographic assay and UCP technology．Mainly,it also reviewed the progress of the
application of this technology and its application in food safety detection．Through the analysis of the advantages and
基金项目：国家自然科学基金项目(21477162)、天滓市科技支撑计划项目(14zCzDSF0021)
Fund：SuppoSed by the National Natural Science Foundation of China(21477162)and the Science and Technology Support Projects of
Tianjin(14ZCZDSF0021)
+通讯作者：高志贤，研究员，主要研究方向为食品安全风险监控技术。E—mail：gaozhx@163．com
+Corresponding author：GAO Zhi·Xian，Researcher,Institute of Health and Environment Medicine，No，1，Dali Road，Tianjin 300050，China．
E—mail：gaozhx@163．com
万方数据
第5期任舒悦，等：上转换发光免疫层析技术及其在食品安全检测中的应用1859
disadvantages of the present technology,the development direction was put forward according to its application field
at present，which provided a reference for the further application of the technology in the field of food safety．
KEY WORDS：up-converting phosphor；immunochromatographic assay；food safety detection
1 引言
“民以食为天”，食品是人类生存的最基本、最重要的
元素，食品安全是关系到亿万人民健康生活的头等大事。
近年来，虽然我国环境状况与过去相比有了长足的进步，
但是随着市场经济的发展和新的有毒有害物质的出现，仍
存在着不少不安全因素，所以，保障食品安全的快速检测
技术需要不断地更新。传统的理化检测方法如液相色谱法、
气质联用法、毛细管电泳法等虽具有准确的突出特点，但存
在样品前处理复杂、耗时费力、成本居高不下等问题，只能
作为疑似样品的确证方法，不能满足质量安全监督现场筛
查的需求【1】。近几年现代生物技术在食品安全检测领域也
得到了一定的应用，例如DNA探针、聚合酶链式反应、生
物芯片及酶联免疫吸附剂测定(ELISA)等技术，具有对靶
标分子高效富集、特异性高、快速检测等优点【2。4】。但这些
技术存在样品前处理复杂、抗体制备困难、生物原料容易
失活、检测微环境要求较高等缺点，限制了其在食品污染
物现场筛查中的广泛应用【5】。因此，建立一种适用于现场
的简单快速食品污染物筛查技术是保障食品安全的必要途
径之一。
2上转换发光免疫层析技术
2．1免疫层析技术
免疫层析技术(immunochromatographic assay,ICA)是
建立在层析技术和抗原一抗体特异性免疫反应基础上的一
项新兴免疫检测技术，具有简单、快速、灵敏度高等特点，
适合现场及大量样品的检测。免疫层析技术以固定有测试
线和质控线的条状纤维层析材料为固定相，以测试液为流
动相，通过毛细管作用使待测物在层析试纸条上移动，经过
检测线时发生特异性免疫反应，游离物在质控线处发生免
疫反应，最后通过测试线颜色的深浅判断测试结果[6l。目前，
最为成熟的现场快速检测技术平台当属免疫层析，其基于
膜的侧向横流检测模式一方面在满足检测敏感性特异性的
前提下，提高了操作的简便性；另一方面提高了试剂的储
存稳定性。但常规使用的胶体金、荧光染料等生物示踪物
由于无法准确定量、荧光蟀灭明显等缺陷，严重限制了免
疫层析技术在食品检测领域的应用。
2．2上转换发光技术
上转换发光(up—converting phosphor，UCP)颗粒是由稀
土元素构成的发光晶体材料，稀土元素具有f电子层赋予
UCP颗粒独特的上转换发光特异，即可由低能的红外光激
发从而发射高能的可见光[71，目前常用的上转换发光材料
主要由稀土元素构成。
基于对UCP颗粒的研究不断深入，上转换发光技术
(up-converting phosphor technology,UPT)应运而生。UPT即
通过对上转换发光纳米颗粒进行表面修饰，包括硅烷化
法、配体交换法、配体氧化法、聚合物包覆法、表面钝化
法及主客分子相互作用等【8‘12】方法将纳米颗粒与生物分子
连接并进行标记以实现在生物成像、药物运输、传感器以
及仪器制造方面的广泛应用【13’18l。由于其作为生物示踪物
可完全排除生物背景荧光干扰，在检测中具有高度的敏感
性、特异性与稳定性。所以，该技术在高通量药物筛选与
输送、基因组学研究、光动力学治疗、组织成像、食品环
境检测以及生物战剂的防御等多方面潜在的应用价值不容
忽视‘1 91。
2．3上转换发光免疫层析技术
上转换发光免疫层析技术(up．converting phosphor
technology-based immunochromatographic assay)是建立在
上转换发光纳米材料与抗原抗体特异结合的层析技术基础
上的一种新兴技术，是以上转换纳米颗粒为标记物的新型
快速检测方法。免疫层析试纸包含5个基本组成部分：样
品垫、结合垫、分析膜、吸水垫、粘性底衬。当进行检测
时，首先将样品滴加到样品垫上，样品通过渗透与虹吸作用
进入结合垫，使其中固定的UCP颗粒与生物活性分子结合
物重新溶解游离，并在吸水垫的虹吸作用下，离开结合垫进
入分析膜，向吸水垫的方向流动。此过程中UCP颗粒与生
物活性分子结合物、目标被检物、检测带c线、质控带T
线之间将特异地发生一定的免疫反应，并通过标记物产生
具有指示性的信号，通过UPT生物传感器进行信号收集
(如图1)，对层析过程中经特异性免疫反应聚集于检测带(T)
和质控带(c)的UCP颗粒的信号进行扫描分析，计算T／C
值即可消除试纸条和加样的系统误差，从而实现快速、简
便、敏感、精确、稳定的定量检测【201。
UCP颗粒作为标记物，与胶体金、磁性纳米材料、乳
胶微球、量子点、荧光素等相比，该标记物属于惰性无机
发光材料，具有耐用性强、稳定性好、有效期长、通量高、
无干扰等特点，已成为标记免疫层析技术的研究热点f2”。
目前，依据在试纸条上所发生免疫反应方式的不同，应用
上转换免疫层析技术检测的反应模式主要可分为夹心模
式、竞争模式与间接模式【221。基于这3种反应模式，上转
换免疫层析技术在临床疾病病原体检测中得到充分的应
万方数据
1860 食品安全质量检测学报第7卷
用。例如，病原微生物(细菌、病毒相关抗原或抗体、寄生
虫相关抗原或抗体)的检测、细胞因子的检测、人体激素疾
病相关蛋白的检测等。其中具有代表性的当属军事医学科
学院微生物流行病研究所的杨瑞馥教授课题组，已经成功
研发出布鲁氏菌、鼠疫耶尔森菌、乙型肝炎病毒、肠出血
性大肠杆菌(大肠杆菌0157)、霍乱弧菌等单靶标UPT免疫
层析试纸条以及UPT十通道多重定量检测试纸盘[23-25】。
抢
测
带
样结分
品合析
垫垫膜
粘
性
底
衬
吸
水
氆
图1 免疫层析反应过程、对应试纸卡‘20
Fig．1 Immunochromatography reaction process and the test card[20
3 上转换发光免疫层析技术在食品安全检测中
的应用
3．1 食源性致病菌的快速检测
目前，上转换发光免疫层析技术在食品安全检测领
域研究逐步开展，集中在食源性致病菌等的研究较多。例
如，刘旭等【26】针对Listeria monocytogenes(LM)特异的p60
蛋白制备单克隆抗体，并与上转发光纳米颗粒共价偶联作
为结合物，采用双抗体夹心免疫层析模式建立
LM．UPT-LF，并对其敏感性与特异性进行评价。建立的
LM．UPT-LF操作简便快速，具有良好的敏感性和特异性，
适用于一线病原调查与检测。又如，北京工业大学马雪梅
课题组[2”将200～300 am的上转换荧光纳米颗粒进行羧基
化修饰，使之成为水溶性好、分散性高且易于与生物分子
偶联的标记物。采用竞争反应模式，建立免疫层析试纸。
近几年，军事医学科学院微生物流行病研究所的杨瑞馥教
授课题组将上转换发光免疫层析技术的应用扩展到了食品
领域，王浩然等【2 8】在成功研制10种可满足食源性致病菌
现场检测需求的UPT单靶标检测试纸的基础上建立
UPT_LF十通道系统(见图2)。其中乙型副伤寒沙门氏菌、
霍乱弧菌01、0139群可达104 CFU／mL；大肠杆菌0157
和甲型副伤寒沙门氏菌可105CFU／mL；肠炎沙门氏菌、猪
霍乱沙门氏菌和副溶血弧菌可达106 CFU／mL；伤寒沙门
氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌可达107 cFu／mL。均可满足
食物样本增菌检测和腹泻样本直接检测的灵敏度需求。／．偷，，／厶＼日少Σ＼
@悸＼≮◆乡6＼哆／／
＼喜：l／／
图2十通道试纸盘结构图∞1(左为内部图，右为外部图)
Fig．2 Ten channel test strip structure diagram[28]
(1eft for the internal structure，right for the external structure)
刘晓等【29】以UCP颗粒作为标记物，无需样品前处理，
采用竞争免疫反应建立AFMl．UPT-LF方法，可实现粉及
牛奶中AFMI定性及定量检测，20 min内即可完成。在定
性检测中，对奶粉检测灵敏度为100％，特异性为85％，具有
较好回收率，可满足食品安全中对现场快速检测的需求。
各种细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。其中颗
粒性抗原的细菌多用液体或固体培养物，经集菌后处理。
一般选择在大肠杆菌表达系统中克隆、表达细菌的蛋白，
经镍柱亲和层析纯化，包涵体形式的表达蛋白经尿素梯度
透析复性，获得有活性的重组蛋白，以各重组蛋白为抗原
分别常规免疫动物，从免疫血清中提取抗体，经正辛酸一
硫酸铵法纯化获得蛋白相应的抗体lgG。再以配对的抗原
抗体为生物材料研制UPT单靶标抗体检测试纸，用UCP
标记抗原，以双抗原夹心模式检测其对应抗体，以含有各
种纯化细菌抗体IgG的血清等为模拟样品。收集血清样本
冻存，按实验设计所需量取出部分，室温平衡后，用样品
处理液1：10倍稀释待测标本，通过对模拟样品的检测评价
各试纸的检测性能。上转换发光免疫层析技术用于食品中
细菌的检测主要还存在以下一些问题：(1)细菌的单克隆
抗体受免疫源性限制，耗时长且制备过程复杂，因此不易
获得，限制了细菌检测的发展；(2)用于食品中细菌检测的
免疫层析试纸条灵敏度不高，部分检测限高于ELISA，而且
万方数据
第5期任舒悦，等：上转换发光免疫层析技术及其在食品安全检测中的应用1861
线性略低也说明了稳定性不是特别好；(3)用于细菌检测的
试纸条的变异系数略偏大，而且不够稳定，也说明了该技术
的精密度还有待提高；(4)处理细菌样品时，难免会有一些复
杂基质，因此在检测时易出现假阳性结果，影响实验。
3．2农兽药残留的快速检测
目前，用于检测食品中农兽药残留的UPT免疫层析
试纸的研究仍未见报道。但天津科技大学张旋旋等(30J首次
应用上转换免疫分析方法检测蔬菜、果汁与水样中的烯啶
虫胺的残留。将纯化得到的烯啶虫胺多克隆抗体偶联到
PAA—UCNPs表面形成信号探针，将烯啶虫胺包被抗原偶
联到聚苯乙烯微球的表面形成感应探针。建立烯啶虫胺的
上转换免疫标准曲线，定量限为l ng／mL．线性范围为
1～10000 ng／mL。测定与其他3种烟碱类杀虫剂与7种其他
类型杀虫剂的交叉反应率很低，具有很好的特异性。并且建
立了与方法匹配的样品前处理方法：选取4种蔬菜样品、4
种果汁样品与4种水样品，对样品前处理条件的进行优化，
消除了样品基质影响，得到一套简单可行的样品处理方法，
建立了一种耗时短、灵敏度高、特异性高、准确性高的简
便、快速、高效的新型上转换免疫分析方法。该研究为研
发食品农兽药残留快速检测UPT免疫层析试纸提供了有
力的依据，具有很大的参考价值。
4面临的问题与展望
美国自1995年开始基于UPT的免疫层析技术研究，
进行生物战剂的现场快速检测与预计，2006年以违禁药品
检测为切入点开始进行民用领域的推广。但在国内研究上
转换颗粒合成及其应用的课题都停留在实验室阶段，并没
有做成用于现场检测的产品，仅有中国科学院、军事医学
科学院、北京热景生物公司等致力于将实验成果转化为惠
及百姓的快检产品。但这些机构的研究多集中在核酸及病
原菌的检测等临床应用方面，在食品安全检测领域的研究
相对较∥31。3引。推测原因其一是食品样品前处理复杂，缺
乏可用于现场快速的有效前处理方法。其二是食品中污染
物大部分属于小分子物质，其单克隆抗体制备困难、容易
失活且检测微环境要求较高等，限制了该技术在食品污染
物快速检测中的广泛应用【361。上转换发光免疫层析技术的
应用存在一些不足之处，但其灵敏度高、特异性强、使用
便捷、检测速度快等优势以及国内外强大的市场需求，预
示着该项技术在食品安全领域具有广阔的应用前景。食品
污染按污染源的性质可分为：生物性污染、化学性污染、
放射性污染。来自生产、生活和环境中的污染物，如农药、
有害金属、多环芳烃化合物、N．亚硝基化合物、包装材料
及涂料等溶入食品中的原料材质、单体及助剂等物质【37】。
近几年，环境中的污染物通过食物链向食品中转移，
对人体内各种组织、器官和细胞产生的低剂量长期内照射
效应不容忽视问题。对人体的危害主要表现为对免疫系统、
生殖系统的损伤和致癌、致畸、致突变作用【381。所以，目
前食品中的各类污染物的监测急需建立一种样品前处理简
单快速、检测灵敏度高、稳定性特异性好的现场筛查技术。
食品中农、兽药残留以及环境中富集到食品中的激素类污
染物的快速检测试纸本课题组正在进行研发，目前少有文
献报道相关研究。本课题组多年来从事化学危险因子、食
源性致病菌、激素类污染物以及农兽药残留等食品安全方
面的风险监控与技术研究。课题组对上转换纳米材料的合
成、修饰以及应用进行了初步探索[39,40]，并将上转换纳米
颗粒与分子印迹技术结合研制出了检测磺胺类药物的生物
传感技术141]。近期课题组致力于农兽药残留的上转换快速
免疫层析试纸的研发，研制出适用于现场快速筛查的便携
式检测技术，应用到实际生活中。
综上所述，建立上转换免疫层析快速检测食品中污
染物残留的单靶标试纸以及研发多靶标定量多通道检测试
纸盘是建立食品安全现场快速筛查技术平台的关键。因此，
以UCP作为标记物发展起来的上转发光免疫层析技术具
有特异性强、敏感性高、稳定性好、储存期长，可同时进
行多重分析且不受检测环境影响等优势，势必在食源性致
病菌、农兽药残留、违禁药品或添加剂、生物毒素、重金
属离子等对人体有害的物质检测领域具有巨大的应用潜力
和发展前景，为保障食品安全开辟了一条崭新的途径。
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f责任编辑：金延秋)
任舒悦，硕士，主要研究方向为上转
换荧光纳米材料的合成与修饰及其在食品
安全检测中的应用。
E-mail：15620163753@163．corn
高志贤，博士，研究员，主要研究方
向为食品安全风险监控技术。
E—mail：gaozhx@163．com

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